Para mantener la integridad genómica, el DNA debe ser protegido del daño provocado por agentes genotóxicos o por alteraciones surgidas durante la replicación. Diferentes mecanismos como la reparación, la recombinación y el checkpoint de daño en el DNA, contribuyen a preservar la integridad del genoma en condiciones que alteran el DNA. Estamos principalmente interesados en el checkpoint de daño en el DNA, y más concretamente en el checkpoint de fase-S, el cual es esencial para mantener la viabilidad celular cuando la replicación ocurre en condiciones de estrés. Una de sus principales funciones es regular las horquillas de replicación, evitando que colapsen cuando se encuentran con lesiones en el DNA, y promoviendo que la replicación continúe una vez que los impedimentos hayan sido eliminados. El checkpoint ejerce este control probablemente a través de múltiples vías, como la regulación directa de algunos componentes del replisoma, así como a través de reguladores positivos y negativos que afectan a la estabilidad de la horquilla directa o indirectamente.

Nuestra investigación está centrada en el estudio de los mecanismos moleculares por los que el checkpoint de fase-S mantiene horquillas de replicación estables y funcionales en condiciones de daño (espontáneo o inducido) durante la replicación del DNA. En el laboratorio estudiamos mediante aproximaciones bioquímicas, genéticas y genómicas, el papel de estas proteínas reguladoras en la estabilidad de las horquillas, así como su mecanismo de acción. Así mismo, estamos interesados en la identificación de nuevas vías de regulación que participen en este proceso.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es el modelo experimental que usamos en el laboratorio. En esta levadura, los componentes de la maquinaria de replicación y del checkpoint están bien caracterizados y evolutivamente conservados, por lo que es un buen modelo genético y bioquímico para el estudio de la regulación de la replicación del DNA en eucariotas.

A) Esquema de la Respuesta del Checkpoint de fase-S.
Cuando la replicación ocurre en presencia de agentes genotóxicos, las kinasas del checkpoint Mec1 y Rad53 son activadas y ejecutan una compleja respuesta que incluye la regulación de la progression del ciclo cellular, la estabilidad de las horquillas de replicación, la activación de orígenes tardíos y la reparación de las lesions en el DNA.
B) Análisis de replicación mediante sustitución de isótopos.
Esta técnica permite estudiar el movimiento de las horquillas de replicación de una region cromosómica, y cuantificar el porcentaje de DNA replicado de una población de células a lo largo del tiempo. Las células bloqueadas en G1, se liberaron en fase S en presencia de HU, y posteriormente, el cultivo se pasó a medio fresco sin HU. La posición del pico correspondiente al DNA no-replicado (HH) y replicado (HL) se indica en la parte superior.
(C) Análisis Fosfo-proteómico de factores involucrados en la estabilidad de horquillas de replicación.